细菌内毒素检测

细菌内毒素检查法（凝胶法）实验程序

• 1. 实验准备：试剂耗材及器具等
  美迪西使用的相关内毒素检测试剂耗材及器具都是经过严格的供应商筛选并采购，市面上公认的且符合要求的相关试剂和器具，如湛江安度斯品牌的内毒素标准品、鲎试剂和检查用水等。
  
  2. 确定药品的细菌内毒素限值（L）
  产品的细菌内毒素限值一般是通过公式L=K/M计算得到的。其中M为人用每千克体重每小时最大供试品剂量，可参考药品说明书或具有权威性资料的用法用量。美迪西专业团队也可提供相关技术指导并结合预筛选试验结果帮助客户快速准确制定相关限度标准。
  3. 计算供试品的最大有效稀释倍数（MVD）或最低有效浓度（MVC）
  4. 复核鲎试剂灵敏度
  5. 药品与鲎试剂相容性的初筛试验
  6. 供试品干扰试验以及干扰试验的验证
  凝胶法系利用细菌内毒素与鲎试剂反应可形成凝胶的原理，来测定供试品中的内毒素含量是否符合规定。反应过程中会受到很多因素的影响，经常存在干扰问题。例如来自样品中的主成分、辅剂、甚至一些杂质等。大部分的干扰作用都可以通过使用细菌内毒素检查用水稀释供试品的方法排除。当有些干扰作用仅使用稀释法不能排除时，可采用其他方法消除干扰因素，然后再进行试验。
  基于文献和实践经验案例等，美迪西整理出一套完善的各类干扰因素和对应的排除方法，能够实现快速精准排除干扰并进行验证试验。
  干扰因素和排除方法汇总表

  干扰因素	排除方法
  pH值的干扰	调节pH值至6.0~8.0
  二价阳离子浓度不足造成的干扰	添加适量Ca2+、Mg2+离子缓冲液
  内毒素聚集造成的干扰	定期涡旋，配制前涡旋
  高浓度盐或糖的干扰	稀释或使用适当超滤设备
  脂质体的干扰	加内毒素分散剂
  内毒素吸附的干扰	首选硼硅酸盐玻璃的稀释管、反应管、刻度吸管，一次性器具应选择聚苯乙烯
  表面活性剂的干扰	试验用生理盐水稀释供试品，生理盐水可使供试品盐化，从而降低其表面活性
  酶、酶抑制剂带来的干扰	将供试品适当加热使酶失活
  葡聚糖的干扰	使用抗增液复溶鲎试剂

  7. 供试品日常的内毒素限量检查。
  8. 可疑结果处理程序

  实验人员首先对实验项目进行回顾：检验用标准、检验操作、记录和计算、仪器状态、.标准物质、试剂质量、其他异常现象（是否有可能存在污染，环境、器械等）复核人员进行复核:若发现检验人员检验过程存在异常，复核人员以正确的检验过程重复实验一次，以取代最初的实验结果。若未发现检验人员检验过程存在异常，为了确定不合格结果是否由测试或分析误差原因造成，复核人员可重复实验。定量试验提供数据参考不同鲎试剂的使用

案例

• 背景：脂质体辅料工艺研发和生产项目，由于限度，客户对于内毒素检测的方法始终没有开发成功，如上所说，内毒素检测中因工艺引入或产品本身存在的一些干扰因素，在稀释到产品最大有效稀释倍数的情况下仍然不能排除干扰，抑制内毒素和鲎试剂的反应导致供试品阳性对照组检测为阴性。
  美迪西微生物团队通过一整套相关干扰因素的排除，基于工艺步骤结合以往经验在短时间内开发出能够排除众多干扰因素的产品前处理方法。
  1. 脂质体水溶性差
  脂多糖的两亲性会使其对一些具有疏水基团的产品具有亲和力，脂多糖与这些产品的结合会使其大小和形状受到影响，以至于影响活性，使内毒素试验受到干扰，形成抑制。 通过加入适量内毒素分散剂使产品中的内毒素分离出来，可恢复内毒素的活性。
  2. 螯合剂干扰
  工艺中引入的试剂含有螯合剂成分会螯合鲎试剂中的二价阳离子（如Mg²⁺离子）从而造成而家阳离子不足造成抑制。同时加入适量Mg²⁺离子缓冲液，排除工艺引入的相关螯合剂导致二价阳离子不足的干扰，从而使内毒素正常激活鲎试剂的酶反应。
  综上排除多种因素干扰，在允许的最大稀释倍数浓度下顺利通过干扰实验的验证并完成限量检查。帮助客户在短周期内实现快速交付。
• 注：
  参考安度斯相关资料
  中国药典2020版四部通则1143 细菌内毒素检查法及
  中国药典2020版四部通则9251 细菌内毒素检查法应用指导原则

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