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美研|CMC系列(十五):杂质制备及结构确证案例分享

2024-06-25
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杂质谱研究要全面的考虑杂质的来源、去向,需要结合具体的反应监控及后处理监控来开展,特别是起始物料的杂质研究,如果起始物料中的杂质研究不够透彻,那么起始物料的杂质就会有很大的可能性继续传递至后续的中间体。

案例分享:对中间体的未知工艺杂质进行制备和结构确证

研究背景

客户委托对中间体M01的未知工艺杂质进行制备和结构确证。该杂质LCMS不电离,无法通过LCMS得到化合物的分子量,在对制备液进行后处理时,旋蒸和冻干都拿不到产物。

❖ 中间体M01的ROS:

中间体M01的ROS.jpg

研究思路

1、对比杂质及中间体的紫外光谱

对比杂质及中间体的紫外光谱.jpg

2、制备情况

1)液相纯度大于98%;
2)waters SQD2碱性体系化合物不电离,酸性体系也不电离;
3)制备液高温、室温旋蒸后都会消失不见;
4)制备液冻干后,检测不出峰。

3、根据以上,可以肯定的以及猜测可能的情况

1)从紫外判断,未知杂质的母核肯定有萘环结构,杂质和中间体M01的紫外吸收完全一致,说明萘环没有连接会导致紫外红移或者蓝移的基团。
2)最有可能的是和萘环直接相连的亚甲基上面发生了变化。
3)不电离,化合物没有ESI源可以电离的基团。
4)旋蒸和冻干后液相检测都不出峰。

怀疑可能的情况有以下三种:
猜想①:杂质沸点低,和蒸汽同时蒸出
猜想②:杂质降解生成了其他的化合物
猜想③:杂质水溶性差,粘在旋蒸瓶壁,没有检测到

猜想过程:
◆ 旋蒸残余的少量液体取出部分进样,根据前面的推测,杂质有萘环,萘环稳定,即使杂质降解,萘环不会被破坏,一定会有新的产物峰出现,但是检测不出峰,推翻猜想②;
◆ 把旋蒸后的溶液加入足量的有机溶剂,超声混合后检测,冻干后的旋蒸瓶中加入有机溶剂溶解后检测,都没有检测到产物,推翻猜想③;
◆ 那么剩下的只有猜想①。

结合化合物结构,起始物料稳定,该步反应是亲核取代反应,反应条件温和,反应过程中的副产物应该都是有胺基存在的,那么杂质在LCMS检测一定会电离;而检测结果证明该杂质没有胺基存在,进一步猜测杂质大概率是由起始物料引入,是起始物料制备过程中产生。

4、SM01的ROS

SM01的ROS.jpg

5、制备液检测GCMS

检测发现杂质分子量是142.2,比萘多了一个甲基,根据制备液GCMS的检测结果,结合起始物料的ROS,起始物料制备过程中可能会产生副产物甲基萘,随后对甲基萘进行调研。

❖ 甲基萘的理化性质:
甲基萘是一种无色油状液体,有类似萘的气味,能与蒸气一同挥发,易燃,不溶于水,易溶于乙醚和乙醇。相对密度(20℃)1.025,沸点245℃,闪点82.2℃。

从甲基萘的理化性质,可以了解到甲基萘可以随蒸汽一同挥发:甲基萘的极性小,水溶性差,制备液中有大量的水存在,在对制备液进行旋蒸和冻干处理时,甲基萘会随着蒸汽同时挥发;这一点很重要,关系到制备液的正确后处理方式。

6、改变制备液后处理方式

◆ 制备液直接使用正己烷萃取,充分振摇后取等体积上清液和下清液用等体积乙醇稀释至相同体积;
◆ 检测甲基萘的含量,发现正己烷层溶液中甲基萘含量高于水层,大概是5:1的比例;
◆ 取正己烷层旋蒸后处理,取一滴旋蒸液加乙醇稀释后进样检测,可以检测到杂质峰,对中间体M01的未知杂质进行定位对比,旋蒸液检测的出峰时间与M01中未知杂质出峰时间一致;
◆ 进而对旋蒸液进行GCMS检测(图1),旋蒸液检测的分子量和制备液检测的分子量一致,确定后处理方法,制备液第一次萃取处理完后再进行第二次萃取,减少样品损失,拿到产物后进行核磁检测确认(图2),确定杂质为1-甲基萘。

图1:GCMS棒状图.jpg

图1:GCMS棒状图

图2:H-NMR.jpg

图2:H-NMR

总 结

未知杂质研究是一个综合性工作,需要的知识也是综合性的,需要研究者能够根据杂质和主成分的检测情况推测可能的结构变化,比如根据杂质和主成分的紫外光谱差异来判断杂质的共轭变化、根据杂质的红外检测情况推断官能团变化、通过质谱确定未知杂质是否含有卤族元素(主要是Cl和Br)以及卤族元素的数目等,还需要研究者有一定的有机化学功底,根据ROS推测反应可能存在的副产物,结合杂质的检测情况综合来判断杂质的结构。

美研|CMC系列回顾

CMC系列(一)|浅谈药物研发中原料药工艺研究的重要性

CMC系列(二)|药学研究之世界银屑病日

CMC系列(三)|高端吸入药物的市场格局和研究现状

CMC系列(四)|浅谈手性药物的研究策略

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