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“感知与反馈”对生物分析实践的启示性意义

2023-07-11
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前言

生物分析能力是药物临床前研究和临床研究的基石能力,是美迪西这类CRO机构助力国内外客户顺利推进药物开发进程的技术基础。生物分析虽然是一门技术性很强实践性很强的工作领域,如果仅就分析看分析,仅就技术本身思考技术对于研发过程中遇到各种情况和问题的解决可能会带来思路上的局限性。做好生物分析工作,离不开技术实践,更离不开相关基础理论知识的支撑,实践反馈理论,理论指导实践,一些基础理论不仅具指导价值,有时也具启发性,有利于广拓视角。美迪西美研小编团队推出生物分析系列专栏,邀请本领域的资深专业人员从不同的视角笔谈生物分析相关的话题。

感知与反馈调节是生命体的一种基本调节能力,机体的感知是实施反馈调节的基础,机体各大生理性系统中都存在着这种感知与反馈的能力,如免疫系统、内分泌系统等无疑都存在着这种基本的能力。感知与反馈调节能力的有些表象可以被生命体直接感受到,而有些表象则比较潜隐,需要一定的检测分析手段才能发现与鉴别。

感知与反馈表面上看仅仅是生理学领域所需要关注的内容而与我们支持药代动力学、毒代动力学以及免疫原性或毒性研究的生物分析领域似乎没有什么关系。其实不然,认识到“感知与反馈”,对于生物分析领域的人员在实践中思考问题、解决问题、分析问题和解释最终数据都有着重要的启示性意义。

I 免疫应答中“感知与反馈”的启示

免疫系统能够感知外来抗原的入侵而产生免疫应答,还可以针对免疫应答的强弱进行反馈和调节,这种能力不仅能表现在应答的有无,还能表现在对量的变化的感知与反馈上。

对于免疫系统的感知与反馈调节能力,在经典的免疫学原理相关教材中都有系统性描述,其中经典的例证就是动物血清交换实验。家兔经某个抗原免疫后,血清中出现了高滴度的抗体,如果用一只未经免疫的家兔的血清与之交换,即人为降低了原家兔的抗体浓度,随后体内会出现一个抗体突然升高的现象,然后重新缓慢下降(图1)。

这种升高,不是因为加注了抗原,而仅仅因为该家兔有效地感知到血清中免疫应答产物即抗体含量突然下降的浓度变化而迅速引起抗体产生量的反馈性升高,达一定强度后则逐渐下降。这一实验现象的描述生动地呈现了免疫系统中重要的感知与反馈调节能力。

Figure-1:机体对抗体浓度变化的感知与反馈性自我调节.jpg

Figure 1 机体对抗体浓度变化的感知与反馈性自我调节

机体免疫系统除了对某抗原产生的抗体浓度变化有感知外,对抗原数量和浓度变化的反应也是其感知的重要方向,有效的免疫应答和抗体的产生在很大程度上取决于抗原剂量。生物技术药物的生物分析往往依赖于免疫分析的技术而离不开抗原-抗体的反应,因而离不开抗体的制备;经常需要考察大分子药物的免疫原性,也离不开抗体变化水平等分析。

其实,在机体内的抗体产生过程中,外来的具有免疫原性的物质(如药物)剂量过高或过低均不易诱导相应特异性抗体的产生,其背后的因素之一就是免疫系统对抗原的感知有其量上的敏感性,不高不低的适量抗原才能有效激发机体的免疫应答产生抗体,剂量过低会出现低带耐受,剂量过高则会出现高带耐受(图2)。

类似的机制也与抗抗体的产生以及抗原特异性记忆性细胞的形成密切相关,如抗抗体只有当抗体数量积累到一定水平后才能出现,记忆性细胞的形成依赖于合适浓度的激发,抗原刺激过弱或过强均不易于诱导出相应的抗原特异性免疫。上述这些方面的机理对在生物分析实践中掌握好机体的抗体形成规律,实施好抗原免疫剂量、把握好抗体制备收集的时间规律,以及分析不同剂量组间免疫原性结果差异、探究细胞免疫的能力差异都有一定的理论提示性作用的。

Figure-2-免疫应答产生抗体依赖于初次免疫应答所用抗原剂量.jpg

Figure 2:免疫应答产生抗体依赖于初次免疫应答所用抗原剂量

II “感知与反馈”对药物免疫原性分析的启示

在生物分析实践中,常会发现所获得的免疫原性的数据并非和给药剂量成很好的正相关性。如果对本文中前一部分知识有所了解,相关人员可能就不会诧异这样的数据结果了。因为药物因其免疫原性所引起的免疫应答进而产生抗体与抗原剂量相关,剂量太高或剂量太低,机体对免疫原的反应并不明显,所以有时我们看到像下图(图3)一样仅仅是中剂量组产生了较为明显的抗药性抗体而影响了药代动力学曲线并不必太奇怪。

当然图3是一个出于笔者实验室的较为典型的例子,有许多情况下,抗药物抗体的出现规律并非都如此,因为在给药剂量设计的时候,并非根据可能引起免疫应答的阈值、强弱或抗原耐受阈值而设计动物试验或临床试验剂量的。如果三个试验剂量组整体剂量都较高,则可能在低剂量组出现较其它剂量组更为明显的抗药物抗体产生;如果三个剂量组都很低,则可能到了高剂量组才刺激机体产生明显的抗药物抗体,这种种免疫原性分析结果的出现的情况都是可能的,因此评判数据时也要注意结合剂量与此机制动态地思考和剖析所获得的免疫原性数据。

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Figure 3:某抗体药中剂量因ADA的产生而影响了PK Profile

对免疫原性的影响的上述描述是比较直观和直接的现象,感知与反馈调节不仅仅影响到免疫原性反应也可能受到外来成分的免疫毒性的干预,调节机能不仅能感知到外在药物浓度的变化,还常伴随着调节因子或受体的参与。具有潜在诱导免疫抑制的药物有可能通过抑制性免疫相关调节因子或受体等间接作用抑制免疫系统活性,引起免疫抑制,潜在会使应答失灵,而可能需要执行TDAR等相关的生物分析考察,甚至分析评价对关键的免疫细胞的数量、比例和/或功能的影响。

当然,具有增强免疫系统活性的药物可能通过激活免疫相关调节因子或受体等激发免疫系统活性,反馈调节可能失衡,潜在引起免疫毒性相关的细胞因子过度释放而需要进行额外的细胞因子分析工作。这些还需要结合具体药物的性质和机理进行考虑。

III “感知与反馈”对的PK分析的启示

内分泌系统是机体的另一大生理系统,其本身就是神经系统外的又一大重要的身体机能调节系统。许多激素类物质都是由内分泌系统分泌,在全身发挥着调节功能。激素一般以相对恒定速度或一定的节律释放,生理或病理因素均可影响激素的基础性分泌,也由机体传感器感知监测和调节激素水平,反馈调节体系是内分泌系统中的重要自我调节机制。激素不仅能执行常规的其生理性网络的调节,也对外来自身物质或自身类似物质的注入很敏感,可以感知自身物质浓度的变化而实行自我反馈调节,通过一定的监测手段,有时我们可以分析到这样的变化。

当前,许多激素都已经被开发成为了药用产品,如甲状旁腺激素(PTH)可用于治疗骨质疏松,胰岛素可以治疗糖尿病等皆已众所周知,还有许多药物研发机构竞相开发或拓展类似的产品。

外源性激素作为药物被研究开发有时也给生物分析领域的药代动力学分析评价带了难题和挑战,因为许多激素类药物都存在内源性对应物,这种情况下,分析的方法和手段有时是较为难以区分内外源物质的。虽然若采用对外源性激素药物进行同位素标记进行分析就可以区分,但并非每一个研究阶段都可以适用这种手段;不能区分的情况下,如果采用假设给药前试验个体的内源性对应物的浓度水平恒定而作为本底扣除的方式或采取扣除统计学意义上得知的受试群体的给药前内源性对应物的平均浓度水平的方式都不是很科学精确,因为内源性物质的分泌往往是动态的、节律性的甚至受个体状态的影响。分泌激素的内分泌细胞会感知靶细胞及血中该激素浓度变化的信息,而执行使其分泌减少或增加的反馈调节,外源性激素引起的浓度变化也是会被感知的。

如果我们预知有些激素当外源性对应物注射入机体以后,内源性对应物的分泌将会相应减少的这一机体感知与反馈调节的规律,内源性对应物对药代动力学分析影响的担忧也就减少甚至可以被忽略。Eli Lilly 的J. Satterwhite等就特立帕肽(Teriparatide)的临床研究报道中指出,I期和III期临床研究的结果表明,注射特立帕肽后内源性甲状旁腺激素分泌则受到显著抑制;因此,内源性甲状旁腺激素对甲状旁腺激素药物定量分析的干扰可以忽略不计,也与笔者实验室就此分析物的研究情况吻合。基于此机理,内源性PTH对生物分析干扰的问题就可从理论和他人实践上得到解决与排除。

笔者实验室在对胰岛素进行药代动力学分析时,也注意并发现了类似的变化规律,我们采用两个高度特异且灵敏的分析方法分别检测外源性胰岛素药物以及内源性胰岛素的浓度,明显发现随着外源性对应物的注入,内源性胰岛素会有显著的减低,随着外源性对应物浓度降低,内源性胰岛素的水平又逐渐升高,基本上是此消彼长的一个对应关系(图4),也基本和我们在开展试验前的理论预期相符合。可能不仅仅是一些激素类有这样的分泌规律,也许不排除其它类内源性物质也有相似的调节规律为我们所利用,值得进一步研究。

Figure-4-内源性胰岛素相应于某外源性胰岛素药物的近乎此消彼长的浓度变化.jpg

Figure 4:内源性胰岛素相应于某外源性胰岛素药物的近乎此消彼长的浓度变化

总结

感知与反馈的这一生理性调节机能普遍存在并且也有许多经典的教材对其进行描述,生命体的许多方面都涉及到类似的调节机制,其内容复杂多变,但这些复杂多变的调节机制为药物的研发提供了基础,当然还有许多机制未彻底阐明,形式可能多样,本文结合笔者所在实践领域和所遇案例,仅就此机制对生物分析实践过程中的一点启示略作浅谈,供大家参考。

生物分析所产生的结果和数据趋势是随不同因素而异的,在不同情况下会受到不同机制的影响,因此针对具体研究内容在制定预案、过程实践和结果分析时往往要结合一些生物学机制等基础理论知识思考,看似这些基础理论离自己很遥远,但对其有所认知的话在需要的时候可以给我们拓宽思路,带来启示,帮助我们在各项生物分析实践中思考、解决或解释问题和结果。

譬如此文所提及这方面的现象和机制提示我们思考具体药物引起特异性免疫应答和抗体分泌的节律与剂量影响的关系;又如具体在研药物内源性对应物是不是潜在具有类似激素的对外源剂量的感知与反馈调节规律从而减少我们实践上的担忧或基于此生物学现象进行一个探索验证以减少或克服后续的担忧;还如除了B细胞免疫分泌抗体受抗原剂量影响外, T细胞免疫也同理应该能对抗原剂量有其感知能力;另外,有感知即有反馈调节,还是两者在某些情况下是否独立的?这种机能在不同情况下会受什么样的剂量阈值限制和影响?低于下限剂量阈值而使感知失灵,高于上限阈值剂量而使反馈调节失能,甚至一些药物因为某方面毒性或剂量而潜在破坏这种感知和反馈调节到稳态范围内而需要从研究上补充额外的分析考察项?等等这些可能都需要我们结合日常实践根据具体案例和具体数据进行多维度地观察与思考。

参考文献:

[1]. Satterwhite, J., et al., Pharmacokinetics of Teriparatide (rhPTH[1–34]) and Calcium Pharmacodynamics in Postmenopausal Women with Osteoporosis [J]. Calcified Tissue International, 2010. 87(6): p. 485-492.

[2]. 周光炎. 免疫学原理[M]. 北京: 科学出版社, 2017.

[3]. 彭双清,郝卫东. 药物安全性评价关键技术[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 2013.

[4].药物免疫毒性非临床研究技术指导原则(征求意见稿)[S]. 北京: 国家药品监督管理局药品审评中心, 2022.

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